New report of Campanula bertolae for North-East Italy (Foresta del Cansiglio, Veneto region) through DNA barcoding technique
Il SIC-ZPS “Foresta del Cansiglio – Regione Veneto” occupa la parte più occi-dentale delle Prealpi Venete-Friulane (Veneto, NE-Italia) e fa parte del massic-cio del Cansiglio-Cavallo (Cancian et al.,1985). La forma è quella di un ampio catino, un polije, dato dalla fusione di varie unità, tra cui Pian Cansiglio è la maggiore. Un’altra di queste è Pian delle Code (comune di Fregona, Treviso), in cui sono stati trovati gli esemplari di Campanula sp. oggetto di studio. Il macro clima del Cansiglio, in base ai dati forniti dall’ARPAV (Servizio meteorologi-co, Ufficio Validazione dati e Climatologia, 2013) può essere definito umido, con stagione fredda, montano. Il prato in cui è stata trovata la popolazione di campanula (1050 m s.l.m.) confina con una Pecceta extrazonale disetanea da inversione termica.
Introduzione
I campioni biologici sono stati da sempre identificati attraverso caratteristiche morfologiche come forma, taglia, colore. Quando questo non è possibile, si può ricorrere a tecniche molecolari di indagine.
Il DNA barcoding è una metodologia che permette l’identificazione delle specie utilizzando il DNA. Per le piante si utilizzano convenzionalmente due regioni del cloroplasto, la maturasi K (matK) e il gene della subunità maggiore dell’en-zima fotosintetico RuBisCO (rbcL) (CBOL Plant Working Group, 2009), le cui sequenze differiscono tra specie diverse ma sono conservate all’interno della stessa specie. In questo studio si è applicata questa tecnica per attribuire la specie di appartenenza di alcuni campioni di Campanula prelevati nell’area di studio.
Materiali e metodi
Nel corso dei rilievi effettuati per la tesi di Dottorato di Ricerca di Borsato (Borsato, 2015), è stata trovata una popolazione di campanule che presenta-vano caratteri morfologici diversi da quelle comunemente presenti nell’area di studio (Campanula rotundifolia L. e Campanula scheuchzeri Vill.). I testi uti-lizzati per la determinazione portavano a varie specie, alcune scartate a priori in base alla corologia (Bernini et al., 2002; Pignatti, 1982; Rothmaler, 1995; Laubere & Wagner, 2001; Aeschimann et al., 2004).
Sono stati allora contattati alcuni floristi, esperti del territorio bellunese e tren-tino, ma non è stato possibile arrivare a una sicura determinazione.
Su 2 esemplari raccolti nella Foresta del Cansiglio-Alpago è stata quindi ese-guita l’analisi del DNA, presso il Laboratorio di Genetica del Prof. Pallavicini (Università di Trieste). Il DNA è stato estratto con E.Z.N.A.®Plant DNA Kit (Omega Biotek Store), quantificato allo spettrofotometro Nanodrop®2000 (Thermo Fisher Scientific) e amplificato tramite reazione a catena della polime-rasi (PCR) per i geni matk e rbcL con Taq DNA polymerase (KAPA Biosystems). La PCR è stata controllata con elettroforesi su gel d’agarosio e i campioni così trattati sono stati spediti al servizio di sequenziamento dell’Istituto di Geno-mica Applicata di Udine (IGA) per l’elettroforesi capillare dei campioni in en-trambe le direzioni della doppia elica, forward e reverse.
Le sequenze così ottenute per ciascun campione sono state appaiate tra loro con il programma Codon Code Aligner (Codon Code Corporation) al fine di ottenere una sequenza di alta qualità.
In seguito, per allineare le sequenze ed evidenziare gli eventuali polimorfismi, si è utilizzato l’algoritmo MUSCLE (Edgar, 2004) contenuto nel programma di analisi Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA6) (Tamura et al., 2013).
Le sequenze sono state confrontate con il data base internazionale del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Geer et al., 2010) per le se-guenti specie: Campanula apennina, C. bertolae, C. marchesettii, C. martini, C. rotundifolia, C. scheuchzeri, C. witasekiana, C. carnica.
Risultati e discussione
Dall’analisi morfologica degli esemplari raccolti nella Foresta del Cansiglio ri-sulta che essi hanno la base del fusto glabra e la papillosità dell’ovario assente. I 2 campioni provenienti dal Cansiglio-Alpago e analizzati per il DNA barco-ding hanno mostrato una similarità del 100% per entrambi i geni di Campanula bertolae. È quindi una segnalazione nuova per questa specie nell’Italia Nord-orientale e nel Veneto. Nella “Flora d’Italia”(Pignatti, 1982) viene data come endemismo delle Alpi Occidentali, presente su pendii aridi e sassosi (serpenti-no) in Piemonte. In “Flora alpina” (Aeschimann et al., 2004) la presenza viene data per certa nelle province di Cuneo, Torino, Bergamo e Brescia e ne viene confermato l’endemismo; risulta presente su una vasta gamma di substrati: pre-feribilmente serpentino, pietre verdi, granito, gneiss, scisti silicei, e, anche se in misura minore, calcare e dolomia. In Cansiglio si sviluppa su scaglia grigia (calcare marnoso).
Ringraziamenti
Grazie al Prof. Pallavicini del Lab. di Genetica dell’Università di Trieste per aver messo a disposizione i mezzi per condurre le analisi, all’agrotecnico Giovanni Roffaré, al Prof. Cesare Lasen, al Dott. Filippo Prosser, al Dott. Franco Fenaroli e al Dott. Carlo Argenti per la disponibilità a discutere circa la determinazione dei campioni.
Bibliografia
Aeschimann D., Lauber K., Moser D.M., Theurillat J.P. (2004) – Flora alpina. Zanichelli.
ARPAV, Servizio meteorologico, Ufficio Validazione dati e Climatologia, 2013, Le prin-cipali variabili meteorologiche del Cansiglio.
Bernini A., Marconi G., Polani F. (2002) – Campanule d’Italia e dei territori limitrofi. Verba & Scripta s.a.s., Pavia.
Borsato V. (2015) – Il sito di interesse comunitario “Foresta del Cansiglio – Regione Ve-neto” (SIC-ZPS IT3230077). Studio fitocenotico delle zone umide e delle praterie quale base della loro gestione naturalistica”. Tesi di Dottorato.
Cancian G., Ghetti S., Semenza E. (1985) – Aspetti geologici dell’Altopiano del Can-siglio, Lavori Soc. Ven. Sc. Nat.,. 10, suppl.: 79-90.
CBOL Plant Working Group (2009) – A DNA barcode for land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences 106: 12794-12797.
Edgar R.C. (2004) – MUSCLE: Multiple sequence alignment with high accuracy and high through put. Nucleic Acids Res. 32: 1792-1797.
Geer L.Y., Marchler-Bauer A., Geer R.C., Han L., He J., He S., Liu C., Shi W., Bry-ant S.H. (2010) – The NCBI Bio Systems data base. Nucleic Acids Research 38: D492-6.
Lauber K., Wagner G. (2001) – Flora Helvetica. Flora illustrèe de Suisse. 2ème edition Haupt.
Pignatti S. (1982) – Flora d’Italia. Ed. Edagricole.
Rothmaler W. (1995) – Exkursionsflora von Deutschland. Gefäßpflanzen: Atlasband.
Ed. Gustav Fischer Verlag Jena-Stuttgart.
Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. (2013) – MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729.